O que é o teste de PCR e como os vírus são descobertos?

O que é o teste de PCR e como os vírus são descobertos?

Este artigo tem como objetivo decifrar o trabalho de um virologista e quais os procedimentos são usados para chegar a conclusão que um novo vírus foi encontrado. Vou começar explicando de maneira breve como o PCR funciona e então vou passar pelas etapas do processo de descoberta de um novo vírus.

Para começar PCR não é um teste é uma ferramenta de engenharia genética usado para copiar, replicar DNA, a partir de um modelo.

PCR (Polymerase Chain Reaction) ou Reação em Cadeia da Polimerase usa uma máquina chamada termociclador, uma amostra de DNA, primers, polimerase DNA, nucleotídeos livres e alguns íons.

A amostra de DNA dever ser purificada usando uma solução que irá, vamos dizer assim, decantar os ácidos nucleicos que serão filtrados.

Os primers são fragmentos de DNA disponíveis comercialmente ou fabricados sob encomenda, onde são utilizados dois primers para cada ciclo do PCR. São os primers que vão copiar uma parte específica da amostra.

Polimerase DNA são enzimas que produzem DNA a partir dos quatro nucleotídeos livres que vão fornecer as quatro nucleobases Adenina (A), Citosina (C), Guanina (G) e Timina (T) para síntese de DNA.

Nucleotídeos livres são os nuclesideos (que são Adenina (A), Citosina (C), Guanina (G) e Timina (T)) ligados ao fósforo, que serão usados para copiar o DNA da amostra.

Todos estes itens são disponíveis comercialmente e devem ser comprados para replicação de fragmentos específicos.

Como o termociclador copia ou amplifica uma amostra de DNA?

A máquina termociclador irá esquentar a amostra a 95° C para quebrar as cadeias de DNA em duas partes, após resfriamento para 65° C os primers irão se ligar em sequências correspondentes, se existir tal correspondência na amostra e usar os nucleotídeos disponíveis pela enzima DNA polimerase. Isto seria um ciclo do PCR.

Então se haver correspondência da sequência do DNA da amostra com o fragmento de DNA dos primers, um novo fragmento de DNA será produzido ou copiado. E a cada ciclo de PCR, será copiado fragmentos criados no ciclo anterior, em cada ciclo, o número de fragmentos de DNA geralmente são dobrados até que a quantidade de enzima e de primers seja consumida.

Bom, se no primeiro ciclo é encontrado uma molécula de DNA, no segundo ciclo teremos duas moléculas, no terceiro quatro e assim por diante e a amostra pode ser considerada positiva ou que contém certo fragmento de DNA.

O problema é que dependendo da forma como esse teste é executado ele pode encontrar qualquer fragmento de DNA em qualquer amostra, se você rodar um número suficiente de ciclos.

Como o próprio criador do PCR, Dr Kary Mullis afirma:

“com PCR, se você fizer certo, pode encontrar quase qualquer coisa em qualquer um.”

Ele comentando sobe o número de ciclos de PCR ou Ct:

“Se você tem que ir além de 40 ciclos para amplificar uma única cópia de um gene, existe algo errado com o seu PCR”

Vale ressaltar que com o PCR, na verdade se consegue copiar ou amplificar somente pequenos fragmentos de DNA e nunca um DNA completo. Existem varias complicações técnicas e de interpretação dos resultados que impossibilita copiar uma molécula inteira de DNA.

O método de amplificação de fragmentos de DNA é utilizado como ferramenta auxiliar na descoberta de novos vírus.

Mas como os vírus são descobertos? Uma simples questão que assim como o funcionamento do PCR, não poderemos explanar em um único artigo, mas quero deixar aqui um norte que servirá de guia para artigos futuros.

Para isso, vou usar como exemplo o artigo da publicação do primeiro “sequenciamento genético” dos três primeiros pacientes com, segundo eles “2019-nCoV” publicado em 24 de janeiro de 2020.

Toda descoberta de “novos vírus”, necessita sempre de amplificação deste material genético para ter uma quantidade mínima para estudos subsequentes. E é aqui que mora o problema.

Bom, quando o virologista recebe uma amostra para análise ele vai excluir a possibilidade dessa amostra não estar “infectada” com outros “patogênicos” conhecidos, Na descoberta do 2019-nCoV do artigo acima, eles usaram um kit para PCR com o nome de RespiFinderSmart22kit.

Após verificado que a amostra não contém patogênicos conhecidos, a amostra será manipulada, filtrada para conter somente material genético, e então eles irão “inocular” ou seja colocar esta amostra em contado com culturas de células (seria células em uma placa de Petri), que no artigo acima, foi usado três diferentes tipos de culturas de células.

Com isso eles afirmam que o suposto vírus vai multiplicar ali. Esta etapa de multiplicação do vírus dura até cinco dias ou mais.

Após a multiplicação, eles irão manipular esta “cultura de células” supostamente com o vírus e usar um método de sequenciamento genético, o método usado por eles foi o “Illumina sequencing” ou NGS, que é um tipo de PCR que usa um método para amplificar todo o material genético da amostra.

Ele basicamente funciona de forma a amplificar cada material genético da amostra, ou seja copiar, e depois substituir as cadeias duplas de DNA por nucleotídeos fluorecentes que irão emitir uma luz diferente para cada tipo de nucleotídeo, possibilitando a identificação de cada um posteriormente, onde cada fragmento de DNA encontrado será organizado pelo tamanho.

Novamente aqui, este método de sequenciamento NGS usa um método proprietário que sequência enquanto sintetiza, ou seja, copia fragmentos de DNA e os classifica de forma que se pode comparar este material genético com o material genético carregados em um banco de dados de genes.

No caso do artigo chinês acima, foi encontrado, segundo eles 20 mil leituras virais sendo que a maioria dos fragmentos obtidos pelo método NGS, são do genoma da linhagem B do gênero betacoronavirus sendo 85% similar a um coronavírus similar ao SARs de morcego e que o resultado se confirmou quando eles executaram um teste de PCR usando para alvo um gene atribuído a este betacoronavirus, mas o resultado somente deu positivo após 34 ciclos. E com isso eles concluem que o vírus foi “isolado”.

Estas conclusões são obtidas usando vários softwares de computador que analisa os fragmentos e os organiza na tentativa de agrupar os mesmo no intuito de identificar a espécie origem dos mesmos, montando, reconstruindo o que seria a posição real de cada fragmento e os comparando com um banco de dados de genes na Internet. No artigo acima eles informam uma lista desses softwares usados no sequenciamento.

Afirmar uma similaridade com o SARs do morcego de 85% é inútil, pois como comparação, o sequenciamento do genoma do homem com o do chimpanzé é de 98.5% de similaridade, e na última vez que eu chequei, eu não me pareço nada com um chimpanzé!

Então eles obtiveram imagens do suposto vírus que parece pertencer a família Coronaviridae. Estas imagens são obtidas com microscópicos eletrônicos, mas esta amostra deve ser processada antes ir para o microscópico.

Para isso é coletado as células com efeito citopático e tratadas com paraformaldeído, glutaraldeído, tetróxido de ósmio com etanol e então manchadas com acetato de urânio e citrato de chumbo. Detalhe: o microscópio eletrônico não filma, somente tira fotos, imagens estáticas.

Este microscópico eletrônico não funciona sem o acetato de urânio e o citrato de chumbo, substâncias altamente tóxicas, será que muitas destas estruturas encontrados nas imagens destes microscópicos não são o resultado de células sem nutrientes com resíduos de pacientes e morrendo, somando a toxicidade do preparo da amostra para a obtenção dessa imagem?

Portanto, a descoberta de novos vírus depende de um número de diferentes produtos, substâncias químicas equipamentos e muitos softwares de computador para análise e agrupamento dos fragmentos encontrados.

Como veremos em artigos futuros, existem vários problemas nestes estudos de sequenciamento de DNA/RNA de vírus por si e a associação destes mesmos a doenças.

O sequenciamento genético NGS amplifica na verdade todo o material genético das células da cultura, a filtragem ou isolamento que este e outros artigos se refere é uma tentativa de diminuir a quantia de outras substâncias que não são ácidos nucleicos da amostra.

Este material genético na verdade são das células da cultura e os detritos genéticos de um paciente com várias substâncias tóxicas que colocam estas células sob estresse e em processo de degeneração onde sabemos que vários compostos são gerados quando algum tecido animal qualquer está se decompondo.

Não fica evidente aqui, que este dito material genético do vírus se multiplicou ou quem sabe estes fragmentos de DNA/RNA encontrados nestas células de culturas e de pacientes doentes, são na verdade, parte do metabolismo celular humano encontrados somente quando os tecidos estão em processo de eliminação de toxinas e/ou morrendo/degenerando.

Em artigos futuros vou procurar detalhar estes processos analisados neste artigo e mergulhar no assunto “doença” o que realmente é a doença, por que temos sintomas, quais outras explicações podemos dar para explicar as doenças comumente conhecidas e o que realmente seria o sistema imunológico.

AVISO: Não sou geneticista, nem virologista, sou uma pessoa comum com acesso a informação tentando descifrar o trabalho dos virologistas, leia as informações contidas aqui com cautela.

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